Zmiany w strukturze przestrzennej norowirusa mogą pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia

Ludzki norowirus (HuNoV) jest jedną z głównych przyczyn ostrych zakażeń przewodu pokarmowego. Szacuje się, że odpowiada za 600-700 milionów infekcji oraz blisko 200 tysięcy zgonów rocznie.

Mimo tak znaczącego wpływu na zdrowie publiczne, obecnie nie istnieją skuteczne terapie przeciwwirusowe przeciwko HuNoV. Dlatego zrozumienie sposobu, w jaki wirus wchodzi w interakcję z komórkami gospodarza i układem odpornościowym, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych metod zapobiegania zakażeniom i ich leczenia.

Jednym z wyzwań stojących przed naukowcami jest to, że HuNoV trudno hodować w konwencjonalnych systemach hodowli komórkowej. Z tego powodu ważnym narzędziem w badaniach nad wirusem stały się cząstki wirusopodobne (VLP, virus-like particles). VLP bardzo wiernie odtwarzają zewnętrzną strukturę norowirusa, ale są znacznie bezpieczniejsze, ponieważ nie mają zdolności zakażania komórek ani namnażania się.

Zewnętrzna osłona wirusa, nazywana kapsydem, odgrywa istotną rolę zarówno w procesie zakażenia norowirusowego, jak i w rozpoznawaniu wirusa przez układ odpornościowy. Niektóre regiony kapsydu uczestniczą w interakcjach z receptorami komórek gospodarza oraz przeciwciałami. Zrozumienie zmian zachodzących w tej strukturze mogłoby pomóc wyjaśnić, w jaki sposób wirus infekuje komórki, a także wesprzeć rozwój nowych szczepionek i terapii przeciwwirusowych.

Wcześniejsze badania nad norowirusem mysim, wariantem zakażającym myszy, wykazały, że wirus ten ma dynamiczną strukturę zdolną do przechodzenia zmian konformacyjnych ze stanu spoczynkowego do stanu wyniesionego (rising state).

Nowe badanie, opublikowane w otwartym czasopiśmie International Journal of Molecular Sciences (IJMS), dostarczyło pierwszych bezpośrednich dowodów strukturalnych na występowanie zmian konformacyjnych u ludzkiego norowirusa. Korzystając z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM), naukowcy scharakteryzowali strukturę cząstek wirusopodobnych HuNoV i zidentyfikowali dwie odrębne konformacje odpowiadające stanowi spoczynkowemu oraz stanowi wyniesionemu. Wyniki badań dostarczają nowych informacji na temat elastyczności strukturalnej HuNoV i mogą pomóc w przyszłym projektowaniu szczepionek oraz opracowywaniu leków przeciwwirusowych.

Bliższe spojrzenie na kapsyd norowirusa

HuNoV składa się z dwóch odrębnych białek:

• VP1: główne białko kapsydu, które tworzy większość zewnętrznej osłony wirusa. Odpowiada ono za wiązanie się z receptorami komórek gospodarza i stanowi główny element rozpoznawany przez układ odpornościowy.

• VP2: mniejsze białko strukturalne, znajdujące się wewnątrz kapsydu, gdzie pomaga stabilizować jego strukturę.

Kapsyd norowirusa zbudowany jest ze 180 kopii białka VP1 ułożonych w strukturę dwudziestościenną (ikosaedralną). Każda podjednostka VP1 zawiera domenę powłoki (shell domain, S), tworzącą główną strukturę kapsydu, oraz domenę wystającą (protruding domain, P), która wysuwa się ponad jego powierzchnię.

Domena P składa się z dwóch subdomen: P1 i P2. Szczególnie istotna jest subdomena P2, ponieważ zawiera regiony uczestniczące w oddziaływaniach z receptorami komórek gospodarza, a także stanowi główny cel przeciwciał. W przeciwieństwie do stosunkowo konserwatywnej domeny S, odsłonięty region P2 różni się między poszczególnymi szczepami norowirusa i jest powiązany z mechanizmami ucieczki przed odpowiedzią immunologiczną. Zmiany kształtu domeny P mogą stanowić dodatkowy sposób modyfikowania przez wirusa rozpoznawania tych regionów przez układ odpornościowy, poprzez zmianę tego, które fragmenty są dostępne dla przeciwciał.

Mechanizm, za pomocą którego wirus reguluje wiązanie się z receptorami oraz rozpoznawanie przez układ odpornościowy, nie jest jeszcze w pełni poznany. Jednak wcześniejsze badania nad norowirusem mysim, który zakaża myszy, wykazały, że domena P może zmieniać swoje położenie w odpowiedzi na warunki środowiskowe, takie jak pH czy obecność jonów metali. U tych wirusów domena ta może przyjmować pozycję spoczynkową, blisko powierzchni kapsydu, lub pozycję wyniesioną, bardziej od niego oddaloną. Ruchy te zmieniają położenie subdomeny P2 na powierzchni kapsydu, co może wpływać na dostępność regionów odpowiedzialnych za wiązanie receptorów i przeciwciał. Do tej pory brakowało jednak bezpośrednich dowodów strukturalnych potwierdzających występowanie podobnych zmian konformacyjnych u ludzkiego norowirusa.

Kapsyd HuNoV istnieje w dwóch formach

Aby sprawdzić, czy u HuNoV mogą zachodzić podobne zmiany, naukowcy wytworzyli cząstki wirusopodobne (VLP) z wykorzystaniem systemu ekspresji bakulowirusowej, który umożliwia produkcję dużych ilości białek w hodowlach komórek owadów. Następnie zastosowali kriomikroskopię elektronową (cryo-EM; ryc. 1A, 1B), aby zobrazować uzyskane cząstki i przeanalizować ich strukturę.

Badacze zidentyfikowali grupę cząstek o średnicy około 40 nanometrów, występujących w dwóch wyraźnie odmiennych formach strukturalnych:

• Stan spoczynkowy (resting state): domeny P pozostawały położone blisko domeny S tworzącej główną strukturę kapsydu (ryc. 1C).

• Stan wyniesiony (rising state): domeny P były uniesione i znajdowały się dalej od domeny S (ryc. 1D).

Pozostałe elementy struktury kapsydu wydawały się identyczne, a główne różnice wynikały z obrotu domeny P o 55° oraz jej przesunięcia o 1,0-1,3 nanometra dalej od powłoki kapsydu.

Stan wyniesiony charakteryzował się również większą elastycznością. Analiza wykazała, że położenie domeny P w tym stanie mogło różnić się o około 11 Å między poszczególnymi cząstkami, podczas gdy w stanie spoczynkowym obserwowano mniejsze przemieszczenia. Ta większa elastyczność utrudniała uzyskanie dokładnego obrazu domeny za pomocą kriomikroskopii elektronowej, co przełożyło się na końcową rozdzielczość 4,7 Å dla domeny P. Chociaż rozdzielczości poniżej 2 Å są na ogół uznawane za bliskie poziomowi atomowemu, na uzyskiwaną rozdzielczość mogą wpływać takie czynniki jak wielkość i złożoność białka oraz elastyczność jego poszczególnych regionów.

Co istotne, obie konformacje zaobserwowano w tej samej oczyszczonej próbce cząstek wirusopodobnych (VLP), wytworzonej w identycznych warunkach. Sugeruje to, że w rzeczywistości oba stany pozostają w równowadze, a różnice konformacyjne nie wynikają z odmienności próbek, lecz stanowią przykład naturalnej zmienności strukturalnej samego kapsydu HuNoV.

Połączenia między białkami VP1

Ruch domeny P wpływał również na sposób oddziaływania sąsiadujących ze sobą białek VP1.

W stanie spoczynkowym sąsiadujące białka P tworzyły połączenia przede wszystkim za pośrednictwem domeny P2. Oddziaływania te pomagały utrzymywać domeny P blisko siebie i zachowywać zwartą organizację powierzchni kapsydu.

Gdy domeny P przechodziły do stanu wyniesionego, oddziaływania zachodzące za pośrednictwem domeny P2 ulegały zaburzeniu. Zamiast tego interakcje przenosiły się na subdomenę P1.

Naukowcy odkryli, że część reszt aminokwasowych uczestniczących w tych oddziaływaniach różni się pomiędzy poszczególnymi szczepami ludzkiego norowirusa. Zmienność w tych regionach może wpływać na oddziaływania stabilizujące stan wyniesiony i stan spoczynkowy, potencjalnie przesuwając równowagę pomiędzy obiema konformacjami. Może to oddziaływać na strukturę domeny P oraz dostępność jej poszczególnych regionów, co może częściowo wyjaśniać, dlaczego różne warianty norowirusa wykazują odmienne właściwości, w tym różnice w interakcjach z receptorami, zakaźności i rozpoznawaniu przez układ odpornościowy.

Czy zmiana kształtu może zmienić charakter infekcji?

Zaobserwowane w tym badaniu zmiany strukturalne, szczególnie dotyczące szczepu GII.3, mogą mieć wpływ na sposób, w jaki norowirus oddziałuje z komórkami gospodarza i układem odpornościowym.

Zmiany strukturalne zaobserwowane w szczepie GII.3 mogą wpływać na interakcje wirusa z komórkami gospodarza oraz układem odpornościowym. Subdomena P2 zawiera regiony uczestniczące w wiązaniu antygenów grup krwi gospodarza (histo-blood group antigens, HBGAs). Uniesienie domeny P zmienia położenie i orientację powierzchni P2, co może wpływać na sposób, w jaki regiony te oddziałują z receptorami i przeciwciałami.

Wcześniejsze badania wykazały, że przeciwciało może wiązać się z norowirusem, niekoniecznie zapobiegając zakażeniu. Sugeruje to, że miejsce wiązania przeciwciała nie jest jedynym czynnikiem decydującym o jego zdolności do hamowania infekcji. Na skuteczność neutralizacji wirusa przez przeciwciała mogą wpływać również kształt i stabilność kapsydu.

Nowo uzyskane struktury dostarczają możliwego wyjaśnienia tego zjawiska. Różnice w sekwencji aminokwasów stwierdzone pomiędzy szczepami norowirusa mogą wpływać na oddziaływania utrzymujące kapsyd w stanie spoczynkowym lub wyniesionym. Może to zmieniać częstość przyjmowania przez wirusa każdej z tych konformacji, a tym samym wpływać na dostępność poszczególnych fragmentów domeny P dla przeciwciał. Różnice w tej równowadze mogą częściowo wyjaśniać, dlaczego dane przeciwciało jest w stanie zneutralizować jeden wariant norowirusa, ale nie inny.

Czy te wyniki mogą wesprzeć proce powstawania szczepionki na ludzkiego norowirusa?

Odkrycie dwóch konformacji kapsydu szczepu GII.3 dostarcza kolejnych dowodów na to, że kapsydy norowirusa są strukturami dynamicznymi, a nie sztywnymi i niezmiennymi.

Nadal jednak pozostaje kilka pytań. Choć naukowcy zaobserwowali oba stany w warunkach zastosowanych w eksperymencie, nie wyjaśnili, co sprawia, że wirus przyjmuje jedną konformację zamiast drugiej. Na równowagę pomiędzy tymi dwoma stanami mogą wpływać zmieniające się w organizmie czynniki środowiskowe, takie jak pH, temperatura oraz poziom tlenu i stężenie soli, jednak nie były one badane w ramach tego eksperymentu.

Zrozumienie mechanizmów kontrolujących to przejście strukturalne mogłoby pomóc ustalić, czy oba stany pełnią różne funkcje podczas zakażenia. Wcześniejsze badania nad norowirusem mysim powiązały zmiany konformacyjne kapsydu z wiązaniem receptorów, zakaźnością oraz unikaniem odpowiedzi immunologicznej, jednak biologiczne znaczenie stanu wyniesionego u ludzkiego norowirusa (HuNoV) pozostaje niejasne.

Uzyskane wyniki mogą w przyszłości wpłynąć na rozwój szczepionek i leków przeciwwirusowych. Ponieważ powierzchnia subdomeny P2 zawiera ważne regiony odpowiedzialne za wiązanie receptorów oraz rozpoznawanie przez układ odpornościowy, zmiany jej położenia i orientacji mogą wpływać na to, które fragmenty kapsydu są eksponowane na działanie układu immunologicznego. Ukierunkowanie terapii na konformacyjne zachowanie kapsydu, zamiast na jego pojedynczą, statyczną strukturę, może otworzyć nowe możliwości opracowywania metod leczenia i szczepionek.

Badanie to przedstawia nowe spojrzenie na strukturę kapsydu ludzkiego norowirusa GII.3, pokazując, że wystające domeny P mogą zmieniać swoje położenie, a powierzchnia wirusa może przyjmować więcej niż jedną formę. Potrzebne będą dalsze badania, aby ustalić, co napędza te zmiany i jakie mają one znaczenie dla procesu zakażenia, jednak odkrycie to stanowi cenny punkt wyjścia do analizowania zmian strukturalnych HuNoV w trakcie jego cyklu życiowego.

Więcej badań z zakresu wirusologii, biologii strukturalnej i chorób zakaźnych można znaleźć na łamach czsaopism MDPI, takich jak Biology, Antibiotics oraz International Journal of Molecular Sciences.

Możesz również zapoznać się z pełną listą czasopism wydawanych przez MDPI.

Artykuł został przetłumaczony z bloga MDPI. Oryginalny tekst znajdziesz tutaj: Norovirus conformational changes may provide insights into novel therapies.